ANALISI CHIMICA DEL (E)-β-CARIOFILLENE

La composizione chimica di PipeNig® è caratterizzata dalla presenza del (E)-β-cariofillene, un sequiterpene idrocarburico (Figura 1).

Pipenig-facts-1

Figura 1: Formula di struttura del (E)-β-cariofillene.

PipeNig® viene analizzato mediante gascromatografia (GC) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) per l’analisi qualitativa dei composti e tramite GC accoppiata a rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) per l’analisi quantitativa. Le analisi quantitative in GC-FID hanno rivelato che la percentuale totale di (E)-β-cariofillene è dell’80% della frazione volatile totale in PipeNig®-FL e del 30% in PipeNig®-PWD. La quantificazione precisa del (E)-β-cariofillene e la sua standardizzazione in PipeNig® permettono la preparazione e il preciso dosaggio di prodotti a base di PipeNig®. Per esempio, in un recente studio pilota (vedi oltre) abbiamo testato l’effetto di capsule contenenti 100 mg di PipeNig®-PWD, corrispondenti a 30 mg di (E)-β-cariofillene. La figura 2 mostra un tipico profilo GC-MS di PipeNig®.

pipenig_fig-2_gc-ms

Figura 2: Profilo cromatografico GC-MS di PipeNig®

PROPRIETÀ ANALGESICHE DI PIPENIG®: STUDIO PILOTA

Il sistema cannabinoide endogeno (ECS) svolge un ruolo importante nella risposta immunitaria a un’infezione. Il recettore cannabinoide CB2 ha una distribuzione sia periferica, a causa della sua espressione sulle cellule immunitarie circolanti, che centrale, essendo espresso nel cervello, nel cervelletto e nelle cellule microgliali. Il recettore CB2 è coinvolto nell’attenuazione delle risposte immunitarie infiammatorie e i ligandi del recettore CB2 inibiscono l’infiammazione e la formazione di edemi, mostrano effetti analgesici, svolgono un ruolo protettivo nel danno epatico da ischemia da riperfusione e prevengono la colite riducendo l’infiammazione e attivano l’immunosoppressione. Gli agonisti selettivi del recettore CB2 sono privi degli effetti collaterali psicoattivi tipicamente associati all’attivazione del recettore CB1 (recettore del THC) e pertanto sono potenziali candidati come valido supporto per una serie di diverse patologie e come sostituti di terapie a base di cannabis.

L’idrocarburo sesquiterpenico (E)-β-cariofillene (BCP, Figura 1) legandosi selettivamente al recettore CB2, è un agonista funzionale del CB2. Il BCP esercita effetti ansiolitici e antidepressivi. La possibilità che il BCP possa migliorare i disturbi dell’umore offre anche interessanti prospettive per studi futuri. Infine, BCP possiede proprietà antiossidanti, prevenendo il danno ossidativo lipidico e migliorando l’attività della glutatione perossidasi, un importante enzima legato alla prevenzione dell’aterosclerosi.

Un numero consistente di studi in vitro e in vivo sul BCP indica che i suoi effetti biologici includono attività antinfiammatorie, antimicrobiche, antiossidanti e analgesiche. Questi effetti biologici derivano dalla capacità di BCP di attivare il recettore CB2. La specificità di BCP per il recettore CB2 implica che la sua azione sia priva degli effetti psicoattivi noti associati all’attivazione di CB1 e suggerisce il suo potenziale utilizzo. Pertanto, BCP offre la possibilità di ottenere un’azione antidolorifica e/o antinfiammatoria in alternativa all’uso della cannabis.

In uno studio pilota condotto dalla Farmacia Centrale (Cambiano, Italia), un campione equilibrato di 31 volontari (19 femmine e 12 maschi, di età compresa tra 36 e oltre 76 anni) che presentavano patologie di dolore acuto (48%) o cronico (52 %) tra cui mal di testa (8%), dolore cervicale (20%), dolore alle articolazioni (32%), dolori muscolari (16%), dolore lombare (12%) e altro dolore (12%), è stato studiato per due mesi e confrontato con diversi FANS. I volontari hanno ricevuto 2 capsule al giorno contenenti 100 mg di PipeNig®-PWD (corrispondenti a 30 mg di BCP bioattivo per capsula) per 10 giorni o 2 capsule al giorno fino al sollievo dal dolore. Per tutti i volontari è stato registrato un punteggio basato su un questionario che riportava la propria esperienza diretta con PipeNig®-PWD. In generale, i volontari hanno riportato una riduzione del dolore del 60% tra il 3° e il 4° giorno dalla somministrazione (Figura 2A) e l’effetto percepito era simile o leggermente inferiore al FANS utilizzato rispettivamente per il 38% e il 31% dei volontari (Figura 2B). Infine, quando ai volontari è stato chiesto se avrebbero in futuro usato regolarmente PipeNig®, oltre il 70% ha risposto affermativamente (Figura 2C). È in corso uno studio sul tessuto adiposo utilizzando le cellule 3T3-L1, una linea di preadipociti molto ben caratterizzata, e su epatociti umani HepG2 per individuare un nuovo approccio preventivo per l’obesità ed il diabete. Verrà perciò testata l’attività antiadipogenica e ipoglicemizzante dell’estratto PipeNig® sia in vitro che in vivo. In particolare sono in corso studi sull’attività biologiche del PipeNig® quali: inibizione dell’adipogenesi, aumento della captazione di glucosio in condizioni di insulino-resistenza, e analisi delle vie di segnalazione intracellulari coinvolte in questi effetti.

Pipenig-facts-2

Figura 3 Risultato dello studio pilota condotto dalla Farmacia Centrale (Cambiano, Italia) su un campione bilanciato di 31 volontari che presentavano patologie del dolore acuto o cronico dopo somministrazione di PipeNig® rispetto a diversi FANS. A, tempistica della riduzione del dolore dopo la somministrazione di PipeNig®. B, percezione dell’effetto di PipeNig® rispetto al FANS solitamente assunto per ridurre il dolore. C, risposta dei volontari alla domanda se avrebbero usato ancora PipeNig® come antidolorifico. I valori sono espressi come percentuale sulle risposte.

L’attenta autenticazione del BCP bioattivo mediante GC-MS e la quantificazione e la standardizzazione mediante GC-FID sono necessarie per preparare dosi efficaci per l’attività analgesica. Il nostro studio pilota indica che PipeNig®-PWD e PipeNig®-FL sono candidati interessanti per lo sviluppo di nuovi preparati antidolorifici naturali per la riduzione delle patologie più dolorose.
Secondo lo studio pilota qui riportato, il dosaggio raccomandato di PipeNig®-PWD è di 100 mg/dose. Questo dosaggio si è dimostrato efficace nelle fasi acute se somministrato due volte al giorno per almeno 10 giorni.
PipeNig®-FL è una fonte liquida priva di alcool con il più alto contenuto di (800 g / kg di BCP standardizzato) disponibile sul mercato ed è particolarmente adatta per tutte le applicazioni liquide, compresi i softgel. Il dosaggio di PipeNig®-FL è di 30-50 mg/dose.

Per un approfondimento sugli studi su PipeNig® si rimanda alla pubblicazione:

Maffei, M. (2018)
PipeNig®. Un estratto di pepe nero (Piper nigrum) con un elevato contenuto standardizzato dell’endo-cannabinoide (E)-β-cariofillene.
L’Integratore Nutrizionale 2018 – 21(3) – (Scarica pdf).

PENIG®-FL RIDUCE L’ACCUMULO DI LIPIDI NEI PREADIPOCITI 3T3-L1

Studi recenti hanno dimostrato che il BCP attiva direttamente il recettore-α (PPARα) 2 attivato dal proliferatore del perossisoma, coinvolto nel metabolismo dei lipidi epatici, e innesca l’attivazione di PPAR3, coinvolto nell’adipogenesi (Machado et al. 2018, Phytother. Res. 32: 2376-88).

Visto il crescente interesse scientifico per il BCP, abbiamo studiato gli effetti metabolici di PipeNig®-FL (Endophyllene®), contenente l’80% di β-cariofillene. In particolare, ci siamo concentrati sulla sua potenziale attività antiobesogenica in vitro in modelli cellulari utilizzando preadipociti 3T3-L1.

Effetti di PipeNig®-FL sulla vitalità delle cellule adipocitiche 3T3-L1

La vitalità a lungo termine delle cellule 3T3-L1 trattate con una vasta gamma di concentrazioni di PipeNig®-FL (100 nM, 1 µM, 10 µM, 100 µM, 1 mM, 10 mM) è stata determinata con il saggio di vitalità CellTiter-Glo® , un metodo basato sulla misurazione del contenuto di ATP, la cui quantità è direttamente proporzionale al numero di cellule metabolicamente attive presenti in coltura. Come mostrato nella Figura 4, la vitalità cellulare è stata ridotta solo a concentrazioni estremamente elevate di PipeNig®-FL (1 mM e 10 mM), con solo una lieve riduzione non statisticamente significativa a 100 μM.

figure-4-viability

Figura 4. PipeNig®-FL ha effetto sulla vitalità cellulare di adipociti 3T3-L1 solo a concentrazioni elevate (millimolari). Le cellule 3T3-L1 sono state indotte a differenziarsi in adipociti per 9 giorni e sono state trattate con concentrazioni crescenti di PipeNig®-FL per l’intero periodo di differenziazione. Il grafico a barre riassume la vitalità cellulare in base al contenuto di ATP. I dati in percentuale riferiti alla condizione di controllo sono rappresentati come media ± errore standard della media (SEM) di tre esperimenti indipendenti. *** p <0,001 vs. controllo.

PipeNig®-FL riduce l’accumulo di lipidi intracellulari nelle cellule 3T3-L1 senza alterare il numero di cellule

La potenziale attività antiadipogenica di PipeNig®-FL è stata valutata sulla linea cellulare preadipocita murina 3T3-L1, un modello cellulare comunemente usato in biologia per la ricerca sulle cellule adipose [Kim et al. 2018, Nutrients 10]. Poiché gli effetti antiadipogenici possono essere esercitati riducendo l’accumulo di lipidi intracellulari e/o il numero di adipociti (sia diminuendo la proliferazione cellulare che inducendo la morte cellulare), abbiamo contemporaneamente analizzato l’accumulo di trigliceridi (dosaggio AdipoRedTM) e il numero di cellule (colorazione NucBlueTM, tramite misurazione del contenuto di DNA). PipeNig®-FL riduce l’accumulo di lipidi intracellulari nelle cellule 3T3-L1 senza alterare il numero di cellule. La Figura 5 mostra immagini rappresentative di colorazione AdipoRed (rosso) e NucBlue (blu) di preadipociti indifferenziati (UNDIFF), adipociti di controllo differenziati (CTRL) e adipociti 3T3-L1 trattati con 10 µM PipeNig®-FL dopo 9 giorni di differenziazione.

figure-5-cells

Figura 5. I preadipociti confluenti, coltivati in piastre da 96 pozzetti, sono stati indotti a iniziare la differenziazione adipogenica e sono stati trattati per tutto il periodo di differenziazione (9 giorni) con un solo composto (0,1% DMSO; controllo differenziato) o con 1 nM, 10 nM, 1 µM, 10 µM PipeNig®-FL. Non sono state utilizzate dosi più elevate di PipeNig®-FL, in base ai dati di vitalità cellulare sopra riportati. Dopo 9 giorni dall’inizio della differenziazione degli adipociti, sono state eseguiti i coloranti AdipoRedTM e NucBlueTM sugli adipociti 3T3-L1.

L’accumulo di trigliceridi e il contenuto di DNA sono stati calcolati come variazione percentuale rispetto ai controlli differenziati trattati con DMSO (Figura 6). Come mostrato in Figura 6a, l’accumulo di trigliceridi per pozzetto è stato ridotto nelle cellule 3T3-L1 trattate con PipeNig®-FL rispetto alle cellule di controllo differenziate; in particolare, sono state ottenute riduzioni statisticamente significative dopo il trattamento con PipeNig®-FL 10 nM, 1 µM e 10 µM. Il contenuto di DNA non era significativamente diverso fra le cellule trattate con PipeNig®-FL e le cellule di controllo, indicando quindi che la diminuzione dell’accumulo di lipidi esercitata da PipeNig®-FL non è dovuta a una diminuzione della proliferazione cellulare o ad effetti citotossici (Figura 6b). D’altra parte, una significativa riduzione del contenuto lipidico intracellulare per cellula è stata trovata a tutte le concentrazioni di PipeNig®-FL (Figura 6c).

figure-6-lipids

Figura 6. (a) Grafico a barre che riassume gli esperimenti di colorazione di AdipoRed per valutare l’accumulo di lipidi su cellule indifferenziate, controllo differenziato e adipociti 3T3-L1 trattati con varie concentrazioni di PipeNig®-FL per 9 giorni, mostrando l’accumulo di trigliceridi per pozzetto. (b) Grafico a barre che riassume gli esperimenti di colorazione di NucBlue per valutare le variazioni del numero di cellule, mostrando il contenuto di DNA per pozzetto. (c) Grafico a barre che mostra l’accumulo di trigliceridi per cellula, calcolato come rapporto tra la colorazione di AdipoRed e NucBlue. I dati in percentuale riferiti a condizioni di controllo differenziate sono rappresentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. * p <0,05; ** p <0,01 vs. controllo.

Lo sviluppo dell’obesità è caratterizzato dall’aumento del numero di cellule adipose (iperplasia) e del loro contenuto lipidico (ipertrofia), a seguito della proliferazione e differenziazione cellulare. Nei nostri esperimenti PipeNig®-FL ha portato ad una significativa riduzione del contenuto lipidico per cellula, senza influire sulla proliferazione cellulare, suggerendo quindi un ruolo nel ridurre la risposta iperiprofica adipocita tipicamente presente nelle condizioni di sovraccarico energetico che caratterizza la sindrome metabolica [Hafidi et al. 2019, Int. J. Mol. Sci. 20, 3657]. I nostri risultati di adipogenesi ridotta indotta da PipeNig®-FL nei pre-adipociti 3T3-L1 supportano l’efficacia dell’estratto grazie al suo elevato e standardizzato contenuto di BCP.

PIPENIG®-FL MIGLIORA L’ASSUNZIONE DEL GLUCOSIO E AGISCE DA INSULINOMIMETICO NELLE CELLULE MUSCOLO SCHELETRICHE C2C12

Il trattamento farmacologico della sindrome metabolica comporta comunemente farmaci anti-obesità, tiazolidinedioni (TZD), metformina, statine, fibrati e molti altri farmaci [Ammazzalorso et al. 2019, Eur. J. Med. Chem. 173, 261–273], ma la sua gestione risiede principalmente nell’adozione di uno stile di vita sano [Aguilar-Salinas e Viveros-Ruiz 2019, F1000Research 8]. Il BCP si è dimostrato un agente ipocolesterolemico e insulinotropico in una dieta ricca di grassi [Youssef et al. 2019, Chem.-Biol. Interagire. 297, 16–24] o in ratti diabetici indotti da streptozotocina [Basha e Sankaranarayanan 2016, Chem. Biol. Interagire. 245, 50–58], dove ha mostrato tossicità non clinica e assenza di effetti collaterali [da Silva Oliveira et al. 2018, Regul. Toxicol. Pharmacol. 92, 338–346]. BCP può rappresentare un trattamento promettente per diversi disturbi metabolici.

PipeNig®-FL non influisce sulla vitalità delle cellule muscolari C2C12

Le cellule di miotubo differenziate C2C12 sono state trattate con concentrazioni crescenti di PipeNig®-FL (100 nM, 50 µM, 200 µM, 1 mM, 10 mM) per 1 h. L’esposizione acuta (1 h) a PipeNig®-FL anche alle dosi più elevate non ha influenzato in modo significativo (p <0,05) la vitalità cellulare (Figura 7).

figure-7-viability-pipenig

Figura 7. PipeNig®-FL non ha alcun effetto sulla vitalità cellulare nelle cellule muscolari C2C12. Le cellule C2C12 sono state trattate con concentrazioni crescenti di PipeNig®-FL per 1 h. I dati in percentuale si riferiscono alla condizione di controllo e sono rappresentati come media ± SEM (n = 3)

PipeNig®-FL migliora l’assorbimento del glucosio nei miotubi C2C12

Per verificare il potenziale ruolo di PipeNig®-FL sull’assorbimento del glucosio nelle cellule muscolo scheletriche, abbiamo eseguito analisi in microscopia a scansione laser confocale utilizzando un tracciante analogo fluorescente del D-glucosio, il 2-NBDG [D-Glucosio , 2-desossi-2 – ((7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-il) ammino) -] che viene utilizzato per monitorare l’assorbimento del glucosio in cellule viventi. Le cellule sono state incubate contemporaneamente per 30 minuti al buio con 100 µM di 2-NBDG e diverse concentrazioni di PipeNig®-FL (1–10–100 nM) in assenza di insulina, mentre l’insulina da sola (25 nM) è stata utilizzata come controllo positivo. Un aumento significativo dell’assorbimento del glucosio è stato osservato nelle cellule trattate con PipeNig®-FL o insulina rispetto alle cellule di controllo, mentre non sono state osservate differenze tra i trattamenti con insulina e PipeNig®-FL o tra le concentrazioni di PipeNig®-FL (Figura 8). Questi risultati indicano che PipeNig®-FL agisce da estratto con effetti potenzialmente insulinomimetici.

figure-8-insulin

Figura 8. PipeNig®-FL stimola l’assorbimento del glucosio. (A) Immagini al miscroscopio confocale di cellule muscolo scheletriche C2C12 (miotubi) incubate per 30 min con l’analogo fluorescente del glucosio, il 2-NBDG. Le immagini sono rappresentate in pseudocolore (LUT = fire) per mostrare meglio le variazioni di intensità della fluorescenza. L’insulina (25 nm) è stata utilizzata come controllo positivo. (B) Grafico a barre che riassume gli esperimenti di assorbimento del glucosio fluorescente. I dati in percentuale riferiti alla condizione di controllo sono rappresentati come media ± SEM (n = 4). * p <0,05; ** p <0,01 vs. controllo.

PipeNig®-FL induce la traslocazione di GLUT4 nella membrana plasmatica delle cellule muscolari C2C12 e agisce come insulinomimetico

Per confermare il coinvolgimento di PipeNig®-FL sul metabolismo del glucosio, abbiamo condotto esperimenti di immunofluorescenza utilizzando l’anticorpo del trasportatore di glucosio di tipo 4 (GLUT4), seguito da un’analisi dettagliata dell’immagine della colorazione periferica rispetto alla fluorescenza interna. GLUT4, noto anche come elemento trasportatore di glucosio facilitato 4 , è una proteina umana ed è il trasportatore di glucosio regolato dall’insulina che si trova principalmente nei tessuti adiposi e nei muscoli striati (scheletrici e cardiaci) [Morgan et al. 2011, Recent. Pat. Endocr. Metab. Immune. Drug Discov. 5, 25–32].

Le cellule sono state trattate per 30 minuti con insulina (25 nM) o con diverse concentrazioni di PipeNig®-FL (1–10–100 nM) in assenza di insulina. È stata osservata un’evidente traslocazione del trasportatore di glucosio dal citosol alla membrana plasmatica sia nelle cellule trattate con insulina che con PipeNig®-FL rispetto alle cellule di controllo, mentre non vi sono state differenze significative nella colorazione tra i trattamenti (Figura 9). Questi risultati confermano il potenziale effetto insulinomimetico di PipeNig®-FL.

figure-9-glucose

Figura 9. PipeNig®-FL induce la traslocazione di GLUT4 sulla membrana plasmatica. (A) Immagini al microscopio confocale della colorazione di immunofluorescenza GLUT4. Dopo la stimolazione con PipeNig®-FL (1–10–100 nM) il segnale fluorescente è chiaramente localizzato nel plasmalemma periferico, indicando così la traslocazione di GLUT4. Le immagini sono presentate in pseudocolore (LUT = Fire) per mostrare meglio le variazioni di intensità della fluorescenza. L’insulina (25 nM) è stata utilizzata come controllo positivo. (B) Grafico a barre che rappresenta il rapporto tra intensità periferica e intensità di fluorescenza interna di GLUT4. I dati sono rappresentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 vs. controllo.

Questi risultati indicano che PipeNig®-FL è efficace quanto l’insulina nella stimolazione dell’assorbimento del glucosio cellulare in vitro. I nostri risultati sono in accordo con studi precedenti che riportano proprietà antidiabetiche di BCP attraverso un rilascio potenziato di insulina [Suijun et al. 2014, Biochem. Biophys. Res. Commun. 444, 451–454]. Inoltre, i miotubi trattati con PipeNig®-FL mostrano una significativa traslocazione di GLUT4 nella membrana plasmatica rispetto al controllo. Quindi la novità interessante di questi risultati è che PipeNig®-FL, un estratto naturale standardizzato ad alto contenuto di BCP, promuove l’assorbimento del glucosio in vitro nei miotubi, probabilmente attraverso un miglioramento del traffico di GLUT4 verso la membrana plasmatica.

Sono in corso esperimenti per ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi molecolari avviati da PipeNig®-FL e per confermare le sue proprietà di induttore anti-lipidogenico e di assorbimento del glucosio in modelli animali.

Per ulteriori approfondimenti sull’attività antiobesogena e insulinomimetica di PipeNig® consultare la pubblicazione:

Geddo F., Scandiffio R., Antoniotti S., Cottone E., Querio G., Maffei M., Bovolin P. e Gallo M.P. (2019)
PipeNig®-FL, a fluid extract of black pepper (Piper nigrum L.) with a high standardized content of trans-β-Caryophyllene, reduces lipid accumulation in 3T3-L1 preadipocytes and improves glucose uptake in C2C12 myotubes
Nutrients 2019, 11 – (leggi pdf)

Start typing and press Enter to search

Don`t copy text!