METODI ANALITICI PER LA DETERMINAZIONE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DEI CURCUMINOIDI DI OXITURMERIC®

I curcuminoidi di OxiTurmeric® sono analizzati mediante HPLC-DAD accoppiata a ESI- spettrometria di massa/massa. L’accurata quantificazione dei curcuminoidi curcumina (CUR), demetossicurcumina (DMC) e bis-demetossicurcumina (BDMC) di OxiTurmeric® si basa sul metodo ufficiale AOAC 2016.16. Dopo l’estrazione con metanolo e la dovuta diluizione, l’estratto viene analizzato mediante HPLC impostando il rivelatore DAD a 425 nm, la colonna C18 (2,6 μm, 2,1 × 30 mm) a 55 ° C di temperatura, utilizzando un volume di iniezione di 0,8 μL e un flusso velocità di 1,4 mL / min. Viene quindi calcolata la concentrazione reale dei curcuminoidi in base a curve di calibrazione ottenute su standard puri. L’identificazione dei curcuminoidi è effettuata tramite HPLC-DAD-ESI-MS/MS.

Molto spesso siamo abituati a vedere affermazioni di curcuminoidi presenti al 95-98%. Qui riportiamo un esempio di un campione di curcuma che vanta di possedere il 98% di curcuminoidi, ma che alla fine si è dimostrato contenere una percentuale reale del 63% di curcuminoidi totali. In pochi passaggi mostreremo come viene eseguita un’analisi tipica dei curcuminoidi.

Il cromatogramma ottenuto da un estratto commerciale di curcuma che vanta il 98% di curcuminoidi è riportato in Figura 1

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Figura 1. Cromatogramma di un estratto di curcuma che vanta il 98% di curcuminoidi.

Leggendo a una lunghezza d’onda fissa (di 425 nm) si prevede che solo i curcuminoidi compaiano nel cromatogramma. Pertanto, se calcoliamo la percentuale totale dei curcuminoidi mostrati in Figura 1 otteniamo i risultati della Tabella 1, dove in realtà le percentuali totali di curcuminoidi sono addirittura superiori al 98% dichiarato.

Tabella 1. Percentuale totale delle aree dei picchi della Figura 1

Composto Tempo di ritenzione (min) Area calcolata Percentuale dell’area
Non identificato 13.03 134.14 0.7%
BDMC 14.88 2355.26 13.0%
DMC 15.34 3136.64 17.3%
Curcumin 15.81 12543.10 69.0%
TOTALE 18169.14 100.0%
Curcuminoidi totali 99.3%

Un errore comune è quello di considerare le percentuali della Tabella 1 come una misura quantitativa dei curcuminoidi presenti nell’estratto di curcuma analizzato. Per quantificare il contenuto reale dei curcuminoidi, la quantificazione viene eseguita con la calibrazione esterna rispetto agli standard di riferimento per CUR, DMC e BDMC, secondo il metodo ufficiale AOAC 2016.16. Per ottenere queste curve, la concentrazione dell’analita (asse x) viene tracciata rispetto all’area del picco integrato individuale per CUR, DMC e BDMC (asse y). L’analisi dei quadrati minimi e la retta di regressione vengono utilizzate per determinare la pendenza, l’intercetta e il coefficiente di determinazione (R2) della linea più adatta per ciascun analita.

Le Figure 2-4 mostrano le tipiche curve di calibrazione ottenute rispettivamente su standard puri di CUR, DMC e BDMC.

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Figura 2. Curva di calibrazione calcolata con lo standard curcumina.

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Figura 3. Curva di calibrazione calcolata con lo standard demetossicurcumina.

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Figura 4. Curva di calibrazione calcolata con lo standard bisdemetossicurcumina.

Sulla base di queste curve di calibrazione esterne, la quantità di curcuminoidi nel campione originale viene calcolata come segue:

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dove C = concentrazione dell’analita dalla curva standard; V = volume estratto; W = peso del campione saggiato (g); e D = fattore di diluizione.

Prendendo in considerazione il calcolo di cui sopra, i dati della Tabella 1 vengono quindi trasformati nei dati quantitativi della Tabella 2

 

Table 2. Analisi quantitativa dei dati della Tabella 1 e della Figura 1 in base alle curve di calibrazione delle Figure 2-4.

Composto Tempo di ritenzione (min) Area calcolata Percentuale dell’area μg dalla curva di cal. mg/g del campione % reale nel campione
Non identificato 13.03 134.14 0.7% nd nd
BDMC 14.88 2355.26 13.0% 0.023 45.7 4.6%
DMC 15.34 3136.64 17.3% 0.043 85.4 8.5%
Curcumin 15.81 12543.10 69.0% 0.248 492.7 49.3%
TOTALE 18169.14 100.0% 0.314 623.8 62.4%
Curcuminoidi totali 99.3% 62.4%

Pertanto, l’uso corretto delle curve di calibrazione mostra come la percentuale totale di curcuminoidi nel campione che vantava una percentuale totale di curcuminoidi del 98% è in realtà del 62,4%

Un’ulteriore conferma dell’identità dei curcuminoidi è data dall’accoppiamento dell’HPLC con una sorgente elettrospray e spettrometria di massa in tandem. Gli spettri di massa tipici di CUR, DMC e BDMC sono illustrati nelle Figure 5-7.

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Figura 5. Frammentazione di massa della Curcumina.

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Figura 6. Frammentazione di massa della Demetossicurcumina.

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Figura 7. Frammentazione di massa della Bis-demetossicurcumina.

METODI ANALITICI PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DEI SISQUITERPENI BISABOLANICI VOLATILI DI OXITURMERIC®

I sesquiterpeni bisabolanici (ad es. Ar-turmerone, α-turmerone, β-turmerone) presenti in OxiTurmeric® sono identificati mediante gascromatografia accoppiata a spettrometria di massa (GC-MS) e quantificati mediante gascromatografia accoppiata a rivelatore a ionizzazione di fiamma (GC-FID ). Questi sono gli unici metodi affidabili per l’analisi dei composti bioattivi volatili della curcuma. Altri metodi (tra cui TLC, UV-Vis, ecc.) non forniscono né l’identificazione precisa dei composti (possibile solo tramite GC-MS) né la loro precisa quantificazione (ottenuta utilizzando GC-FID con curve di calibrazione esterne di standard puri e l’impiego di standard interni).

Il tipico profilo GC-FID di OxiTurmeric® è illustrato nella Figura 8.

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Figura 8. Cromatogramma GC-FID di OxiTurmeric® che mostra la presenza di diversi sesquiterpeni. Questa analisi viene utilizzata per la determinazione quantitativa dei sesquiterpeni volatili bioattivi di OxiTurmeric® utilizzando sia le curve di calibrazione esterne con standard puri che tramite l’utilizzo di standard interni (come ad esempio il trans-nerolidolo).

L’identificazione dei principali sesquiterpeni di OxiTurmeric® è ottenuta tramite GC-MS come mostrato nella Figura 9.

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Figura 9. Spettri di massa dei principali sesquiterpeni bisabolanici contenuti in OxiTurmeric®. Ogni singolo lotto è sottoposto a severi controlli GC-FID e GC-MS per fornire sempre un prodotto standardizzato.

OXITURMERIC® È BIODISPONIBILE A LIVELLO CELLULARE – COME DIMOSTRATO SU CELLULE UMANE HEPG2

La capacità antiossidante degli alimenti e degli integratori alimentari è spesso misurata dalla reazione chimica dell’estratto vegetale o ingrediente con fonti di ROS. I metodi più utilizzati sono: ORAC, TRAP, FRAP, TEAC, DPPH, ecc. Questi test sono test chimici tradizionali che non danno informazioni sulle funzioni fisiologiche degli antiossidanti e sono stati screditati per anni e fortemente criticati dalle principali autorità di monitoraggio sanitario (come ad esempio, EFSA e USDA).

Questo è il motivo per cui abbiamo testato la biodisponibilità e la capacità di OxiTurmeric® di attivare le risposte a livello cellulare utilizzando la tecnologia innovativa basata su LUCS (Light-Up Cell System) un approccio brevettato (EP2235505 e US20110008783) sviluppato dalla Anti Oxidant Power Company, Toulouse , Francia (per ulteriori dettagli, vedere gli approfondimenti su OxiP®).

Per dimostrare che OxiTurmeric® è biodisponibile a livello cellulare, abbiamo eseguito il saggio biologico ARE/Nrf2 su di cellule vive, che utilizza un gene reporter che misura la capacità del campione di attivare la sequenza di promotore del DNA ARE (Antioxidant Response Element) dopo il rilascio nucleare del fattore di trascrizione Nrf2 dal complesso citosolico Keap1/Nrf2. Questa via genomica, nota anche come “la difesa naturale antiossidante delle cellule“, ha la capacità di aumentare la capacità delle cellule di adattarsi allo stress ossidativo o al danno cellulare (Ma, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2013: 53: 401-426). La via Nrf2-ARE mostra cambiamenti dinamici ed è stata studiata per il suo ruolo neuroprotettivo (Gan & Johnson, Biochim. Biophys, Acta-Mol. Basis Dis. 2014,1842: 1208-1218). Nelle cellule HepG2-Nrf2, la sequenza di promotore di ARE è accoppiata all’espressione dell’enzima luciferasi che, in presenza di luciferina, catalizza la produzione del composto luminescente ossiluciferina.

OXITURMERIC® AGISCE DA CITOPROTETTORE ATTRAVERSO L’ATTIVAZIONE DELLA VIA ARE/NRF2

OxiTurmeric® ha la capacità di agire a livello cellulare, mostrando così una chiara biodisponibilità. L’interazione di OxiTurmeric® provoca un evidente effetto sulla difesa cellulare antiossidante naturale di cellule umane HepG2 (la via ARE/Nrf2). Sono state valutate diverse concentrazioni per determinare la massima espressione genica. Il valore più elevato di espressione genica (5.11 volte rispetto al controllo) si ottiene con una concentrazione di 12.5 mg/ml, mentre la minima concentrazione in grado di attivare l’espressione genica è di 6.25 mg/ml (Figura 10).

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Figura 10. Effetto di OxiTurmeric® sulla via ARE/Nrf2. La variazione dell’espressione genica rappresenta la capacità di OxiTurmeric® di aumentare la difesa cellulare antiossidante naturale in cellule umane HepG2. A 12,5 mg/ml, OxiTurmeric® attiva 5 volte di più le auto-difese antiossidanti delle cellule rispetto al controllo.

L’assenza di additivi esterni e la pura caratteristica “tutta naturale” di OxiTurmeric® mostrano una EC50 di 5,60 mg/ml, senza alcun effetto citotossico osservato dopo 17 ore di trattamento a qualsiasi concentrazione saggiata (Figura 11). La biodisponibilità e la capacità di attivazione genica di OxiTurmeric® è garantita dalla presenza naturale di un alto livello di curcuminoidi insieme ai turmeroni volatili, che aumentano la biodisponibilità senza l’aggiunta di altre molecole sintetiche.

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Figura 11. Rappresentazione grafica dose-risposta di OxiTurmeric® ottenuta su esperimenti eseguiti in triplicato. I dati mostrano che OxiTurmeric® non è citotossico e che l’EC50 (che è una concentrazione di efficacia del 50%, calcolata sull’adattamento sigmoideo dose-risposta) è di 5,60 mg/ml con un elevato coefficiente di determinazione (R2 = 0,984). Le barre rappresentano la deviazione standard.

In conclusione, OxiTurmeric® mostra una biodisponibilità dimostrata a livello cellulare in cellule umane HepG2. OxiTurmeric® attiva le difese naturali antiossidanti delle cellule umane e non mostra effetti citotossici a tutte le concentrazioni esaminate. OxiTurmeric®, agendo sulla via ARE/Nfr2 ha la potenzialità di aumentare la capacità delle cellule di adattarsi allo stress ossidativo o al danno cellulare stimolando anche la neuroprotezione.

OXITURMERIC® NON CONTIENE ZEDERONE

Presenza del composto epatotossico ZEDERONE negli estratti di curcuma

Diversi studi hanno dimostrato che alcuni sesquiterpeni (ad es., Zederone, Figura 12) mostravano tossicità epatica, che si basa principalmente sulla formazione di metaboliti reattivi, aumento della concentrazione di specie reattive dell’ossigeno e compromissione della difesa antiossidante (Zarybnicky et al., 2018, Archives of Toxicology, 92 (1): 1-13).

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Figura 12. Spettro di massa e struttura chimica del composto tossico zederone

La sofisticazione della Curcuma può avvenire tramite miscelazioni con Curcuma comosa Roxb. ampiamente coltivata in Tailandia come fonte per la medicina tradizionale wan chak motluk, comunemente usata per il trattamento dei sintomi della menopausa (contiene diarileptanoidi estrogenici), o con Curcuma elata, il cui rizoma contiene un’alta percentuale del sesquiterpene zederone (Pimkaew et al. 2013, Toxicol In Vitro 27: 2005-2012). L’epatotossicità del sesquiterpene zederone è stata dimostrata in estratti di Curcuma elata (Pimkaew et al 2013, Int J Toxicol 32: 454-462). Lo zederone è anche un tipico sesquiterpene trovato in Curcuma kwangsiensis (Liu et al, 2016, Chin Med 11:21), Curcuma zedoaria (Hamdi et al, 2014, Scientific World Journal, numero articolo: 321943) e in Curcuma amada Roxb (Akter, et al, 2019, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 12 (3): 123-129), dove mostra una forte citotossicità contro le cellule KG1a (Anuchapreeda et al, 2018, Natural Product Communications, 13 (12): 1615-1618).

OxiTurmeric® non contiene zederone come dimostrato dalle nostre analisi GC-MS

La ricerca dei frammenti di massa del sesquiterpene zederone in OxiTurmeric® ha dimostrato la completa assenza di questo composto, indicando che OxiTurmeric® è sicuro ed è prodotto esclusivamente da piante di Curcuma longa.

OXITURMERIC® È NATURALE AL 100% COME DIMOSTRATO DALLE ANALISI 14C

Abbiamo ricercato la possibile presenza di sostanze artificiali in OxiTurmeric® attraverso l’analisi del radiocarbonio 14C. La curcuma naturale ha un livello di 14C del 100% di origine organica. D’altra parte, la curcuma prodotta interamente da componenti derivati dal petrolio ha un livello di 14C dello 0% ed è quindi naturale allo 0%. Un prodotto costituito da biomassa (estratti vegetali) e sostanze chimiche a base di petrolio o addizionato con molecole sintetiche avrà un contenuto organico naturale tra 0% e 100% proporzionatamente alla quantità di ciascun componente nel prodotto. Il valore di OxiTurmeric® 14C è del 99,9% ± 3,7 indicando la pura origine naturale dell’estratto.

L’ANALISI DELLA DISCRIMINAZIONE DELL’ISOTOPO STABILE DELL’IDROGENO RIVELA LA DIFFERENZA TRA OXITURMERIC®, ESTRATTI DI CURCUMA CONTENENTI FOSFOLIPIDI E CURCUMA SINTETICA

Le misure di rapporti isotopici stabile dell’idrogeno (D/H o δ2H) nei tessuti delle piante fungono da traccianti conservativi di massa d’acqua. Grandi frazioni isotopiche negative si verificano nelle reazioni biochimiche durante la sintesi di composti organici nella pianta (White J. W. C., 1989, in: Stable Isotopes in Ecological Research, Springer-Verlag, New York). Pertanto, maggiori sono i valori negativi del δ2H, maggiore è la composizione organica (e naturale) di un estratto vegetale.

Biosfered, in collaborazione con la società ISO4 S.n.c. (University Spin-Off), ha analizzato la composizione isotopica stabile dell’idrogeno di OxiTurmeric® rispetto ad alcuni estratti commerciali di curcuma noti per contenere fosfolipidi o dichiarati contenere curcuminoidi sintetici. Il metodo utilizzato è stato descritto da Coleman et al. (Anal. Chem., 1982, 54, 993-995) facendo reagire l’acqua dei campioni con zinco in una provetta sotto vuoto a 500 ° C. Il gas idrogeno risultante viene analizzato per la composizione isotopica da uno spettrometro di massa con rapporto isotopico gassoso. La precisione dell’analisi isotopica dell’idrogeno è determinata dal campionamento ripetuto di uno standard di laboratorio calibrato in relazione all’acqua oceanica media standard (V-SMOW2, δ2H) secondo quanto definito dall’Agenzia Internazionale per l’Energia Atomica (AIEA). La precisione delle misurazioni dello standard di laboratorio era ± 20/00. La composizione isotopica è espressa usando la notazione delta in parti per mille (0/00) come mostrato di seguito:

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dove R è il rapporto molare tra l’isotopo pesante e quello leggero (D/H).

La Figura 13 mostra i rapporti isotopici stabili dell’idrogeno di OxiTurmeric® rispetto a prodotti commerciali selezionati dichiarati contenenti fosfolipidi o con curcuminoidi sintetici. I valori positivi discriminano gli estratti di curcuma sintetica (mostrati nel quadrante azzurro in alto a destra della figura), mentre i valori negativi discriminano gli estratti di curcuma ottenuti da pianta (quadrante arancio in basso a sinistra). È interessante notare che il δ2H è in grado di discriminare gli alti valori negativi di OxiTurmeric®, che contiene solo molecole sintetizzate da Curcuma longa (curcumonoidi e turmeroni volatili), da valori meno negativi di estratti di curcuma che sono stati preparati con fosfolipidi aggiunti all’estratto per aumentarne la biodisponibilità.

oxiturmeric-delta2h

Figura 13. Rapporti dell’isotopo stabile dell’idrogeno di OxiTurmeric® rispetto a valori di prodotti commerciali selezionati dichiarati contenere fosfolipidi o preparati con curcuminoidi sintetici. Grandi frazioni isotopiche negative si raggiungono nelle reazioni biochimiche durante la sintesi di composti organici nella pianta; pertanto, l’aggiunta di altri composti all’estratto produce valori più positivi. OxiTurmeric® mostra i valori più negativi.

La nostra analisi isotopica dell’idrogeno stabile dimostra che è possibile discriminare gli estratti di curcuma sintetici da quelli naturali. OxiTurmeric®, che contiene solo componenti di Curcuma longa, mostra valori di δ2H più negativi rispetto agli estratti. Questo metodo rapido ed economico può essere utilizzato per rivelare potenziali modificazioni degli estratti naturali di Curcuma longa.

OXITURMERIC® GARANTISCE LA STABILITÀ DEI CURCUMINOIDI DURANTE IL PROCESSO DIGESTIVO

Biosfered, in collaborazione con EcamRicert (una società di innovazione e ricerca) ha valutato il comportamento di OxiTurmeric® durante il processo digestivo. OxiTurmeric® (1000 mg, equivalente a 850 mg di curcuminoidi e 150 mg di turmeroni) è stato esposto ad una procedura di digestione in vitro progettata per simulare il processo fisiologico nell’uomo (compartimenti orali, gastrici e intestinali). Alla fine del processo digestivo, OxiTurmeric® digerito è stato centrifugato ottenendo il surnatante, corrispondente alla frazione bioaccessibile e la matrice digerita, normalmente escreta attraverso le feci. Sono state raccolte le diverse frazioni e i curcuminoidi [ad es. la curcumina (C), la demetossicurcumina (DMC) e la bisdemetossicurcumina (BDMC)] sono stati analizzati mediante HPLC-DAD-FD-ESI-MS/MS.

La bioaccessibilità si riferisce alla quantità di principio attivo rilasciato dalla sua matrice nel tratto gastrointestinale e disponibile per l’assorbimento. Per determinare la bioaccessibilità attiva di OxiTurmeric®, è stata utilizzata una procedura di digestione in vitro per simulare l’età adulta umana. Questo esperimento mira a valutare la quantità di curcuminoidi rilasciati dalla matrice e disponibili per l’assorbimento, vale a dire la frazione bioaccessibile. Come mostrato nella Tabella 3, il contenuto totale di curcuminoidi misurato alla fine del processo digestivo ha mostrato un recupero del 76,5% (cioè rapporto tra contenuto di curcuminoidi misurato e atteso). Questi risultati indicano una buona stabilità curcuminoide OxiTurmeric® durante il processo digestivo.

Tabella 3. Stabilità dei curcuminoidi contenuti in OxiTurmeric® dopo digestione in vitro. I dati sono espressi come media ± deviazione standard

Curcuminoidi attesi (μg/mL) Curcuminoidi misurati (μg/mL) Recupero (%)
OxiTurmeric® 44700.0 34189.9 ± 198.2 76.5 ± 0.4


OXITURMERIC® È SICURO PER LE CELLULE EPITELIALI INTESTINALI

I monostrati intestinali sono stati esposti a concentrazioni crescenti di OxiTurmeric® digerito ed è stata ottenuta una curva dose-risposta (Figura 14). Come evidenziato dalla curva dose-risposta, OxiTurmeric® mostra effetti negativi sull’epitelio intestinale solo a concentrazioni molto elevate (13,16 grammi per litro!). La più alta concentrazione non tossica di OxiTurmeric® è stata trovata a 8,77 grammi / litro, una concentrazione estremamente più alta del dosaggio suggerito (300-500 mg / giorno / persona).

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Figura 14. Impatto della concentrazione crescente di OxiTurmeric® digerito sulla vitalità della mucosa intestinale valutata mediante saggio MTS.

I CURCUMINOIDI DI OXITURMERIC® VENGONO ASSORBITI A LIVELLO INTESTINALE, CONFERMANDO LA LORO TENDENZA AD ACCUMULARSI A LIVELLO INTRACELLULARE, PER ESSERE POI RILASCIATI IN TEMPI SUCCESSIVI

Poiché un fattore che limita la biodisponibilità dei curcuminoidi è la loro tendenza ad accumularsi nel tratto intracellulare prima di essere rilasciati nel flusso sanguigno, abbiamo misurato l’accumulo intracellulare di curcuminoidi OxiTurmeric® a livello intestinale. È stato osservato un accumulo intracellulare di curcuminoidi OxiTurmeric®, con un assorbimento intracellulare del 25,6 ± 5,4%. Pertanto, l’assorbimento complessivo della curcumina dalla frazione bioaccessibile, considerando sia il compartimento serosal che la concentrazione intracellulare, è di 240,8 ± 50,1 mg / L dopo 3 ore di esposizione.

Dopo 3 ore di esposizione a OxiTurmeric® digerito, sono state analizzate sia la vitalità di monostrati di cellule Caco-2 che l’integrità della barriera. OxiTurmeric® non ha causato una riduzione significativa della vitalità delle cellule Caco-2 (Figura 15 pannello di sinistra). Per quanto riguarda la vitalità, non è stata evidenziata alcuna alterazione significativa della barriera intestinale a seguito del trattamento con OxiTurmeric® digerito (Figura 15 pannello destro).

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Figura 15. Vitalità epiteliale intestinale (pannello sinistro, espressa in percentuale di vitalità) e permeabilità apparente (pannello destro, espressa in cm/min) in seguito all’esposizione a fluidi digestivi (controllo) e OxiTurmeric® digerito diluito per 3 ore.

Inoltre, OxiTurmeric® digerito ha ridotto il TEER (potenziale elettrico transepiteliale) solo temporaneamente, e i suoi valori si ripristinano completamente entro 24 ore, proprio come i controlli (Figura 18).

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Figura 18. Andamento della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) dopo 3 ore di esposizione a OxiTurmeric® digerito. Si nota lo stesso effetto del controllo, indicando l’assenza di effetti dannosi.

In conclusione, OxiTurmeric®, un estratto di curcuma contenente ESCLUSIVAMENTE componenti naturali da rizomi di Curcuma longa, garantisce la stabilità dei curcuminoidi durante il processo digestivo. I curcuminoidi di OxiTurmeric® vengono assorbiti a livello intestinale, confermando la loro tendenza ad accumularsi a livello intracellulare, come ci si attende da una curcuma pura e naturale, per essere poi rilasciati lentamente in tempi successivi per un’efficacia efficiente e naturale.

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