ATTENZIONE: A PARTIRE DA MAGGIO 2020 IL MARCHIO PIPENIG® È SOSTITUITO DAL NUOVO MARCHIO ENDOPHYLLENE® CHE INCLUDE L’INTERA LINEA DI PRODOTTI A BASE DI β-CARIOFILLENE PRODUCTS.

Da questa data, i prodotti Pipenig-PWD e Pipenig-FL vengono rinominati rispettivamente con le seguenti denominazioni commerciali: ENDOPHYLLENE®-P PWD and ENDOPHYLLENE®-P FL.

ANALISI CHIMICA DEL (E)-β-CARIOFILLENE

La composizione chimica di Endophyllene® è caratterizzata dalla presenza del (E)-β-cariofillene, un sequiterpene idrocarburico (Figura 1).

Pipenig-facts-1

Figura 1: Formula di struttura del (E)-β-cariofillene.

Endophyllene® viene analizzato mediante gascromatografia (GC) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) per l’analisi qualitativa dei composti e tramite GC accoppiata a rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) per l’analisi quantitativa. Le analisi quantitative in GC-FID hanno rivelato che la percentuale totale di (E)-β-cariofillene è dell’80% della frazione volatile totale nelle versioni fluide (FL) di Endophyllene® e del 30% nelle versioni polvere (PWD). La quantificazione precisa del (E)-β-cariofillene e la sua standardizzazione permettono la formulazione di prodotti a base di Endophyllene® con dosaggio preciso. La figura 2 mostra un tipico profilo GC-MS di Endophyllene®-P, versione ottenuta a partire dal pepe nero (Piper nigrum).

pipenig_fig-2_gc-ms

Figura 2: Profilo cromatografico GC-MS di Endophyllene®-P

PROPRIETÀ ANALGESICHE DI ENDOPHYLLENE®: STUDIO PILOTA

Il sistema cannabinoide endogeno (ECS) svolge un ruolo importante nella risposta immunitaria a un’infezione; è coinvolto nell’attenuazione delle risposte immunitarie infiammatorie, i suoi ligandi inibiscono l’infiammazione e la formazione di edemi, mostrano effetti analgesici, svolgono un ruolo protettivo nel danno epatico da ischemia da riperfusione, prevengono la colite riducendo l’infiammazione e attivano l’immunosoppressione. Il recettore cannabinoide CB2 ha una distribuzione sia periferica che centrale; infatti è espresso rispettivamente nelle cellule immunitarie circolanti e nel Sistema Nervoso Centrale (cervello, cervelletto e cellule microgliali).

L’idrocarburo sesquiterpenico (E)-β-cariofillene (BCP, Figura 1) legandosi selettivamente al CB2, è un agonista funzionale del recettore e non genera effetti psicoattivi collaterali dovuti invece all’attivazione del recettore CB1 con cui il BCP non interagisce. Il BCP esercita effetti ansiolitici e antidepressivi. La possibilità che il BCP possa migliorare i disturbi dell’umore offre anche interessanti prospettive per studi futuri. Un numero consistente di studi in vitro e in vivo sul BCP indica che i suoi effetti biologici includono attività antinfiammatorie, antimicrobiche e analgesiche. Infine, BCP possiede proprietà antiossidanti, prevenendo il danno ossidativo lipidico e migliorando l’attività della glutatione perossidasi, un importante enzima legato alla prevenzione dell’aterosclerosi.

In uno studio pilota condotto dalla Farmacia Centrale (Cambiano, Italia), un campione equilibrato di 31 volontari (19 femmine e 12 maschi, di età compresa tra 36 e oltre 76 anni) che presentavano patologie di dolore acuto (48%) o cronico (52 %) tra cui mal di testa (8%), dolore cervicale (20%), dolore alle articolazioni (32%), dolori muscolari (16%), dolore lombare (12%) e altro dolore (12%), è stato studiato per due mesi e confrontato con diversi FANS. I volontari hanno ricevuto 2 capsule al giorno contenenti 100 mg di PipeNig®-PWD (oggi denominato Endophyllene®-P PWD), corrispondenti a 30 mg di BCP bioattivo per capsula, per 10 giorni o 2 capsule al giorno fino al sollievo dal dolore. Per tutti i volontari è stato registrato un punteggio basato su un questionario che riportava la propria esperienza diretta con il prodotto. In generale, i volontari hanno riportato una riduzione del dolore del 60% tra il 3° e il 4° giorno dalla somministrazione (Figura 3A) e l’effetto percepito era simile o leggermente inferiore al FANS utilizzato rispettivamente per il 38% e il 31% dei volontari (Figura 3B). Infine, quando ai volontari è stato chiesto se avrebbero in futuro usato regolarmente questo prodotto, oltre il 70% ha risposto affermativamente (Figura 3C).

Pipenig-facts-2

Figura 3 Risultato dello studio pilota condotto dalla Farmacia Centrale (Cambiano, Italia) su un campione bilanciato di 31 volontari che presentavano patologie del dolore acuto o cronico dopo somministrazione di PipeNig® (oggi denominato Endophyllene®-P PWD) rispetto a diversi FANS. A, tempistica della riduzione del dolore dopo la somministrazione. B, percezione dell’effetto del BCP rispetto al FANS solitamente assunto per ridurre il dolore. C, risposta dei volontari alla domanda se avrebbero usato ancora questo prodotto come antidolorifico. I valori sono espressi come percentuale sulle risposte.

L’attenta autenticazione del BCP bioattivo mediante GC-MS e la quantificazione e la standardizzazione mediante GC-FID sono necessarie per preparare dosi efficaci per l’attività analgesica. Il nostro studio pilota indica che Endophyllene ® è un candidato interessante per lo sviluppo di nuovi preparati antidolorifici naturali per la riduzione delle patologie più dolorose.
Secondo lo studio pilota qui riportato, il dosaggio raccomandato di Endophyllene ® nelle versioni in polvere è di 100 mg/dose. Questo dosaggio si è dimostrato efficace nelle fasi acute se somministrato due volte al giorno per almeno 10 giorni.
Le versioni fluide di Endophyllene® prive di alcool sono particolarmente adatte per tutte le applicazioni liquide, compresi i softgel; il dosaggio consigliato per queste forme fluide è di 30-50 mg/dose.

Per un approfondimento sugli studi su PipeNig® (oggi denominato Endophyllene®-P) si rimanda alla pubblicazione:

Maffei, M. (2018)
PipeNig®. Un estratto di pepe nero (Piper nigrum) con un elevato contenuto standardizzato dell’endo-cannabinoide (E)-β-cariofillene.
L’Integratore Nutrizionale 2018 – 21(3) – (Scarica pdf).

ENDOPHYLLENE® RIDUCE L’ACCUMULO DI LIPIDI NEI PREADIPOCITI 3T3-L1

Studi recenti hanno dimostrato che il BCP attiva direttamente i PPARα (Peroxisome proliferator-activated), coinvolti nel metabolismo dei lipidi epatici, e innesca l’attivazione di PPARγ, coinvolto nell’adipogenesi (Machado et al. 2018, Phytother. Res. 32: 2376-88).

Visto il crescente interesse scientifico per il BCP, abbiamo studiato gli effetti metabolici di PipeNig®-FL (oggi denominato Endophyllene®-P FL), contenente l’80% di β-cariofillene. In particolare, ci siamo concentrati sulla sua potenziale attività antiobesogenica in vitro in modelli cellulari utilizzando preadipociti 3T3-L1.

Effetti di Endophyllene® sulla vitalità delle cellule adipocitiche 3T3-L1

La vitalità a lungo termine delle cellule 3T3-L1 trattate con una vasta gamma di concentrazioni di BCP (80%, contenuto all’interno di Endophyllene® fluido) (100 nM, 1 µM, 10 µM, 100 µM, 1 mM, 10 mM) è stata determinata con il saggio di vitalità CellTiter-Glo® , un metodo basato sulla misurazione del contenuto di ATP, la cui quantità è direttamente proporzionale al numero di cellule metabolicamente attive presenti in coltura. Come mostrato nella Figura 4, la vitalità cellulare è stata ridotta solo a concentrazioni estremamente elevate di BCP (1 mM e 10 mM), con solo una lieve riduzione non statisticamente significativa a 100 μM.

figure-4-viability

Figura 4. Il BCP ha effetto sulla vitalità cellulare di adipociti 3T3-L1 solo a concentrazioni elevate (millimolari). Le cellule 3T3-L1 sono state indotte a differenziarsi in adipociti per 9 giorni e sono state trattate con concentrazioni crescenti di BCP contenuto all’interno di Endophyllene® per l’intero periodo di differenziazione. Il grafico a barre riassume la vitalità cellulare in base al contenuto di ATP. I dati in percentuale riferiti alla condizione di controllo sono rappresentati come media ± errore standard della media (SEM) di tre esperimenti indipendenti. *** p <0,001 vs. controllo.

Endophyllene® riduce l’accumulo di lipidi intracellulari nelle cellule 3T3-L1 senza alterare il numero di cellule

La potenziale attività antiadipogenica è stata valutata sulla linea cellulare preadipocita murina 3T3-L1, un modello cellulare comunemente usato in biologia per la ricerca sulle cellule adipose (Kim et al. 2018, Nutrients 10). Poiché gli effetti antiadipogenici possono essere esercitati riducendo l’accumulo di lipidi intracellulari e/o il numero di adipociti (sia diminuendo la proliferazione cellulare che inducendo la morte cellulare), abbiamo contemporaneamente analizzato l’accumulo di trigliceridi (dosaggio AdipoRedTM) e il numero di cellule (colorazione NucBlueTM, tramite misurazione del contenuto di DNA).

Endophyllene® riduce l’accumulo di lipidi intracellulari nelle cellule 3T3-L1 senza alterare il numero di cellule.

La Figura 5 mostra immagini rappresentative di colorazione AdipoRed (rosso) e NucBlue (blu) di preadipociti indifferenziati (UNDIFF), adipociti di controllo differenziati (CTRL) e adipociti 3T3-L1 trattati con 10 µM di BCP dopo 9 giorni di differenziazione.

figure-5-cells

Figura 5. I preadipociti confluenti, coltivati in piastre da 96 pozzetti, sono stati indotti a iniziare la differenziazione adipogenica e sono stati trattati per tutto il periodo di differenziazione (9 giorni) con un solo composto (0,1% DMSO; controllo differenziato) o con 1 nM, 10 nM, 1 µM, 10 µM di BCP contenuto all’interno di Endophyllene®. Non sono state utilizzate dosi più elevate di BCP, in base ai dati di vitalità cellulare sopra riportati. Dopo 9 giorni dall’inizio della differenziazione degli adipociti, sono stati visualizzati i coloranti AdipoRedTM e NucBlueTM sugli adipociti 3T3-L1.

L’accumulo di trigliceridi e il contenuto di DNA sono stati calcolati come variazione percentuale rispetto ai controlli differenziati trattati con DMSO (Figura 6). Come mostrato in Figura 6a, l’accumulo di trigliceridi per pozzetto è stato ridotto nelle cellule 3T3-L1 trattate con BCP rispetto alle cellule di controllo differenziate; in particolare, sono state ottenute riduzioni statisticamente significative dopo il trattamento a 10 nM, 1 µM e 10 µM. Il contenuto di DNA non era significativamente diverso fra le cellule trattate e le cellule di controllo, indicando quindi che la diminuzione dell’accumulo di lipidi esercitata dal BCP non è dovuta ad una diminuzione della proliferazione cellulare o ad effetti citotossici (Figura 6b). D’altra parte, una significativa riduzione del contenuto lipidico intracellulare per cellula è stata trovata a tutte le concentrazioni testate (Figura 6c).

figure-6-lipids

Figura 6. (a) Grafico a barre che riassume gli esperimenti di colorazione di AdipoRed per valutare l’accumulo di lipidi su cellule indifferenziate, controllo differenziato e adipociti 3T3-L1 trattati con varie concentrazioni di BCP per 9 giorni, mostrando l’accumulo di trigliceridi per pozzetto. (b) Grafico a barre che riassume gli esperimenti di colorazione di NucBlue per valutare le variazioni del numero di cellule, mostrando il contenuto di DNA per pozzetto. (c) Grafico a barre che mostra l’accumulo di trigliceridi per cellula, calcolato come rapporto tra la colorazione di AdipoRed e NucBlue. I dati in percentuale riferiti a condizioni di controllo differenziate sono rappresentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. * p <0,05; ** p <0,01 vs. controllo.

Lo sviluppo dell’obesità è caratterizzato dall’aumento del numero di cellule adipose (iperplasia) e del loro contenuto lipidico (ipertrofia), a seguito della proliferazione e differenziazione cellulare. Nei nostri esperimenti Endophyllene® ha portato ad una significativa riduzione del contenuto lipidico per cellula, senza influire sulla proliferazione cellulare, suggerendo quindi un ruolo nel ridurre la risposta ipertrofica adipocitica tipicamente presente nelle condizioni di sovraccarico energetico che caratterizza la sindrome metabolica (Hafidi et al. 2019, Int. J. Mol. Sci. 20, 3657). I nostri risultati di adipogenesi ridotta indotta da Endophyllene® nei pre-adipociti 3T3-L1 supportano l’efficacia dell’estratto grazie al suo elevato e standardizzato contenuto di BCP.

ENDOPHYLLENE® MIGLIORA L’ASSUNZIONE DEL GLUCOSIO E AGISCE DA INSULINOMIMETICO NELLE CELLULE MUSCOLO SCHELETRICHE C2C12

Il trattamento farmacologico della sindrome metabolica comporta comunemente farmaci anti-obesità, tiazolidinedioni (TZD), metformina, statine, fibrati e molti altri farmaci (Ammazzalorso et al. 2019, Eur. J. Med. Chem. 173, 261–273), ma la sua gestione risiede principalmente nell’adozione di uno stile di vita sano (Aguilar-Salinas e Viveros-Ruiz 2019, F1000Research 8). Il BCP si è dimostrato un agente ipocolesterolemico e insulinotropico in una dieta ricca di grassi (Youssef et al. 2019, Chem.-Biol. Interagire. 297, 16–24) o in ratti con diabete indotto da streptozotocina (Basha e Sankaranarayanan 2016, Chem. Biol. Interagire. 245, 50–58), dove ha mostrato tossicità non clinica e assenza di effetti collaterali (da Silva Oliveira et al. 2018, Regul. Toxicol. Pharmacol. 92, 338–346). Il BCP può rappresentare un trattamento promettente per diversi disturbi metabolici.

Endophyllene® non influisce sulla vitalità delle cellule muscolari C2C12

Le cellule di miotubo differenziate C2C12 sono state trattate con concentrazioni crescenti di BCP (100 nM, 50 µM, 200 µM, 1 mM, 10 mM) per 1 h. L’esposizione acuta (1 h) al BCP anche alle dosi più elevate non ha influenzato in modo significativo (p <0,05) la vitalità cellulare (Figura 7).

figure-7-viability

Figura 7. Endophyllene® non ha alcun effetto sulla vitalità cellulare nelle cellule muscolari C2C12. Le cellule C2C12 sono state trattate con concentrazioni crescenti di BCP per 1 h. I dati in percentuale si riferiscono alla condizione di controllo e sono rappresentati come media ± SEM (n = 3).

Endophyllene® migliora l’assorbimento del glucosio nei miotubi C2C12

Per verificare il potenziale ruolo del prodotto sull’assorbimento del glucosio nelle cellule muscolo scheletriche, abbiamo eseguito analisi in microscopia a scansione laser confocale utilizzando un tracciante analogo fluorescente del D-glucosio, il 2-NBDG che viene utilizzato per monitorare l’assorbimento del glucosio in cellule viventi. Le cellule sono state incubate contemporaneamente per 30 minuti al buio con 100 µM di 2-NBDG e diverse concentrazioni (1–10–100 nM) di BCP in assenza di insulina; mentre l’insulina stessa (25 nM) è stata utilizzata come controllo positivo.

Un aumento significativo dell’assorbimento del glucosio è stato osservato nelle cellule trattate con Endophyllene® o insulina rispetto alle cellule di controllo, mentre non sono state osservate differenze tra i diversi trattamenti compreso quello con insulina (Figura 8). Questi risultati indicano che Endophyllene® è un estratto che agisce con effetti potenzialmente insulinomimetici.

figure-8-insulin

Figura 8. Il BCP stimola l’assorbimento del glucosio. (A) Immagini al miscroscopio confocale di cellule muscolo scheletriche C2C12 (miotubi) incubate per 30 min con l’analogo fluorescente del glucosio, il 2-NBDG. Le immagini sono rappresentate in pseudocolore (LUT = fire) per mostrare meglio le variazioni di intensità della fluorescenza. L’insulina (25 nm) è stata utilizzata come controllo positivo. (B) Grafico a barre che riassume gli esperimenti di assorbimento del glucosio fluorescente. I dati in percentuale riferiti alla condizione di controllo sono rappresentati come media ± SEM (n = 4). * p <0,05; ** p <0,01 vs. controllo.

Endophyllene® induce la traslocazione di GLUT4 nella membrana plasmatica delle cellule muscolari C2C12 e agisce come insulinomimetico

Per confermare il coinvolgimento dei prodotti Endophyllene® sul metabolismo del glucosio, abbiamo condotto esperimenti di immunofluorescenza utilizzando la versione Endophyllene fluida ottenuta da pepe nero (Endophyllene®-P FL, prima noto come Pipenig®-FL) e l’anticorpo del trasportatore di glucosio di tipo 4 (GLUT4), seguito da un’analisi dettagliata dell’immagine della colorazione periferica rispetto alla fluorescenza interna. GLUT4, noto anche come elemento trasportatore di glucosio facilitato 4 , è una proteina umana ed è il trasportatore di glucosio regolato dall’insulina che si trova principalmente nei tessuti adiposi e nei muscoli striati (scheletrici e cardiaci) (Morgan et al. 2011, Recent. Pat. Endocr. Metab. Immune. Drug Discov. 5, 25–32).

Le cellule sono state trattate per 30 minuti con insulina (25 nM) o con diverse concentrazioni (1–10–100 nM) di BCP in assenza di insulina. È stata osservata un’evidente traslocazione del trasportatore di glucosio dal citosol alla membrana plasmatica sia nelle cellule trattate con insulina che con Endophyllene® rispetto alle cellule di controllo, mentre non vi sono state differenze significative nella colorazione tra i trattamenti (Figura 9). Questi risultati confermano il potenziale effetto insulinomimetico di Endophyllene®.

figure-9-glucose

Figura 9. Il BCP induce la traslocazione di GLUT4 sulla membrana plasmatica. (A) Immagini al microscopio confocale della colorazione di immunofluorescenza GLUT4. Dopo la stimolazione con Endophyllene® alle concentrazioni 1–10–100 nM, il segnale fluorescente è chiaramente localizzato nel plasmalemma periferico, indicando così la traslocazione di GLUT4. Le immagini sono presentate in pseudocolore (LUT = Fire) per mostrare meglio le variazioni di intensità della fluorescenza. L’insulina (25 nM) è stata utilizzata come controllo positivo. (B) Grafico a barre che rappresenta il rapporto tra intensità periferica e intensità di fluorescenza interna di GLUT4. I dati sono rappresentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 vs. controllo.

Questi risultati indicano che il prodotto Endophyllene® è efficace quanto l’insulina nella stimolazione dell’assorbimento del glucosio cellulare in vitro. I nostri risultati sono in accordo con studi precedenti che riportano proprietà antidiabetiche di BCP attraverso un rilascio potenziato di insulina (Suijun et al. 2014, Biochem. Biophys. Res. Commun. 444, 451–454). Inoltre, i miotubi trattati con Endophyllene® mostrano una significativa traslocazione di GLUT4 nella membrana plasmatica rispetto al controllo. Quindi la novità interessante di questi risultati è che Endophyllene®, un estratto naturale standardizzato ad alto contenuto di BCP, promuove l’assorbimento del glucosio in vitro nei miotubi, probabilmente attraverso un miglioramento del traffico di GLUT4 verso la membrana plasmatica.

Sono in corso esperimenti per ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi molecolari avviati da Endophyllene® e per confermare le sue proprietà di induttore anti-lipidogenico e di assorbimento del glucosio in modelli animali.

Per ulteriori approfondimenti sull’attività antiobesogena e insulinomimetica di Endophyllene® (ex PipeNig®) consultare la pubblicazione:

Geddo F., Scandiffio R., Antoniotti S., Cottone E., Querio G., Maffei M., Bovolin P. e Gallo M.P. (2019)
PipeNig®-FL, a fluid extract of black pepper (Piper nigrum L.) with a high standardized content of trans-β-Caryophyllene, reduces lipid accumulation in 3T3-L1 preadipocytes and improves glucose uptake in C2C12 myotubes
Nutrients 2019, 11 – (leggi pdf)

Start typing and press Enter to search